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竞争内源性RNA在骨肉瘤发生发展中的作用研究进展
摘要  

骨肉瘤是最常见的儿童和青少年原发恶性骨肿瘤,具有恶性程度高、进展迅速、转移潜能高的特点。近几十年来,骨肉瘤的治疗并没有取得明显的进展,其主要原因是对骨肉瘤的发病机制缺乏系统和深入的认识。越来越多的证据表明,不同种类RNA在骨肉瘤的发生发展中起着关键的调控作用。竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)是近年来兴起的学说,是指信使RNA(messenger RNA,mRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、假基因等不同转录物之间通过竞争结合微小RNA(microRNA,miRNA)发挥相互调控作用。这些转录物之间的相互调控在骨肉瘤发生发展中起着重要作用,包括介导骨肿瘤细胞增殖、凋亡、转移、化疗耐药等生物学过程。此外,这些不同种类的转录物还可能为骨肉瘤提供新的生物标志物和潜在的有效治疗靶点。通过回顾ceRNA假说的发展历程,并对ceRNA的现有知识体系进行归纳,阐述了不同类型ceRNA在骨肉瘤发生发展机制中的相互作用及其涉及的生物学功能,以期为骨肉瘤的基础及临床研究奠定基础,促进骨肉瘤的早期诊断和治疗预后。


骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,约占所有原发骨肿瘤的20%,具有临床症状不明显、恶性程度高、易复发及转移、预后差的特点,多数患者在确诊时即发生了转移[1]。自20世纪70年代以来,化疗结合手术治疗的方法使非转移性骨肉瘤患者五年生存率大幅提高,但确诊时存在转移或复发的患者十年总生存率仍不到20%[2,3]。近几十年来,骨肉瘤的治疗并没有实质性的进展。因此,进一步探索骨肉瘤的发病机制、寻找骨肉瘤治疗的靶点及生物标志物对突破其治疗瓶颈至关重要。


人类转录组由2%的编码RNA和98%的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)组成[4]。后者曾在很长一段时间内被认为是基因转录的副产物或"暗物质",缺乏生物学功能。随着高通量测序技术的快速发展,许多以前被认为是垃圾分子的ncRNA被发现并被证明在细胞的多种生理和病理过程中发挥重要作用[5,6],ncRNA在生物学中的地位也得到提升。竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)学说是近年来兴起的一种全新的基因表达调控学说[7],在该学说中各种类型的RNA通过竞争性结合相同的微小RNA(microRNA,miRNA)来调节彼此的表达,从而在转录后水平控制基因表达。这些RNA通过miRNA相互影响、相互调控,形成了ceRNA调控网络,通过调控疾病相关基因的表达发挥作用[8]


ceRNA是RNA领域近年来的研究热点之一,虽然提出的时间不久,但已被证实在结直肠癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等常见恶性肿瘤的发生发展中起重要调控作用[9,10,11,12]。近年来,越来越多的关于ceRNA与骨肉瘤的文章揭示了其在骨肉瘤复杂分子调控网络中的作用。本综述通过回顾ceRNA假说的发展历程,并对ceRNA的现有知识体系进行归纳,阐述不同类型ceRNA在骨肉瘤发生发展机制中的相互作用及其涉及的生物学功能,以期为骨肉瘤的基础及临床研究奠定基础,促进骨肉瘤的早期诊断和治疗预后。


一、检索策略

本文以"骨肉瘤"、"竞争内源性RNA"为中文关键词在万方数据库、中国生物医学文献数据库、维普中文科技期刊数据库以及中国知网检索平台进行检索,并以"(osteosarcoma)AND(ceRNA OR competing endogenous RNA)"为检索式在PubMed数据库、以"(TS=osteosarcoma)AND(TS=ceRNA)OR(TS=competing endogenous RNA)"为检索式在Web of Science数据库进行检索。限定文献发表时间为2000年1月至2021年4月。文献纳入标准为:①期刊论文、综述、学位论文等类型文献;②优先选择近期发表或发表在权威杂志的文献。排除标准:①非重点研究ceRNA与骨肉瘤相关的文献;②无法获得全文的文献;③重复性研究;④非英文的外文文献。


共检索到相关文献413篇,其中英文文献377篇、中文文献36篇;最终纳入文献82篇,包括英文文献78篇、中文文献4篇(图1)。

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图1 文献筛选流程图。在中英文数据库中共检索出413篇文献,根据纳入及排除标准最终纳入文献82篇


二、ceRNA概述

ceRNA学说的理论基础最早可追溯到2007年。Franco-Zorrilla等[13]发现植物中的一种长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可隔离miR-399并解除其对靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的抑制;几乎在同一时间,Ebert等[14]报告了一种导入哺乳动物细胞的miRNA抑制剂,它能像海绵吸水一样吸附miRNA,从而阻断miRNA对靶标产生的生物学功能,因此作者将其形象地称为"miRNA海绵";之后,Seitz[15]发现生物体内存在可作为"miRNA海绵"的天然miRNA靶标,通过竞争结合miRNA抑制其对其他靶标的功能。Poliseno等[16]在2010年进一步完善了这一理论,他们发现一些蛋白编码基因及其假基因在3’非翻译区(3’UTR)中包含相同的保守miRNA结合位点,可以通过竞争miRNA结合[15]调控各自的表达水平。基于这些发现,Salmena等[7]提出了ceRNA学说,即mRNA、假基因和lncRNA等不同的转录物可作为ceRNA,通过miRNA应答元件(miRNA response element,MRE)竞争相同的miRNA来调控其他具有相似MRE的RNA的活性,miRNA如同一种新语言介导了这些不同转录物的交流,而MRE则为这种语言的文字(图2)。

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图2 前体miRNA在细胞核内经微处理后进入细胞质,在细胞质中被Dicer酶剪切为成熟的miRNA,成熟的miRNA与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物(miRISC)。通常,miRISC与靶RNA的3’UTR上的MRE结合后,会导致靶mRNA的表达抑制或降解。具有相同MRE的不同类型RNA(mRNA、lncRNA、circRNA)、转录假基因以及病毒转录物作为ceRNA竞争结合miRNA,从而阻碍miRNA结合靶mRNA,解除靶mRNA编码蛋白抑制。在这个调控机制中,miRNA作为中介赋予了ncRNA、假基因等转录物调控编码RNA的功能;相反,靶mRNA也能通过竞争结合miRNA调节其他mRNA,形成调控网络。通过此途径,这些不同转录物在细胞中产生生物学功能


miRNA是一类长度为21~23 nt的参与基因转录后表达的非编码小RNA[17]。在经典的miRNA合成途径中,前体miRNA在细胞核经过微处理后转运到细胞质,并在细胞质中被Dicer酶剪切为成熟的miRNA,与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物(miRNA-induced silencing complex,miRISC)。通常,miRISC与靶RNA的3’UTR上的MRE结合,会导致靶mRNA抑制或降解[18]。值得注意的是,许多mRNA包含多个不同的MRE[19],因此每个mRNA可能被多个不同的miRNA调控;反之亦然,每个miRNA可能调控多个具有相同MRE的不同mRNA。理论上,任何含有MRE的转录物都可以结合miRNA作为潜在的ceRNA,他们通过与编码RNA竞争结合miRNA,从而解除miRNA对编码基因的抑制作用。目前发现可作为ceRNA发挥功能的转录物包括mRNA、lncRNA、假基因、环状RNA(circular RNA,circRNA)、病毒RNA等[20,21]。这些不同种类的转录物相互影响和调控,构成RNA转录物的多维调控网络,扩展了人类基因组的功能。


既往研究表明ceRNA的活性由以下五个因素决定:①miRNA与ceRNA的相对浓度,miRNA与ceRNA的浓度差异过大可引起ceRNA的调控功能失效,当ceRNA的水平接近相等时ceRNA活性最强[22];②ceRNA与miRNA的结合亲和力,每个转录物的结合亲和力和抑制程度可能不同,作为ceRNA的转录物其竞争结合miRNA的效果受其各自与mi RNA结合亲和力的影响,亲和力越高竞争能力越强,两种RNA之间共享的miRNA类型越相似其竞争关系越强[22,23];③ceRNA主成分的亚细胞位置,一些miRNA的表达具有细胞类型、时间和空间特异性,因此ceRNA可能只在共享miRNA表达活跃的特定细胞或特定环境中显露活性[24,25];④RNA编辑,通过核苷酸的插入、删除和替代改变mRNA中的遗传信息影响RNA分子的稳定性或改变RNA分子上的miRNA结合位点,从而影响ceRNA活性[26];⑤RNA结合蛋白,参与RNA剪接、稳定和降解等多种转录后调控,可以通过直接占据RNA靶点或改变RNA二级结构从而降低RNA对miRNA的亲和力来影响ceRNA的相互作用[27,28]


三、骨肉瘤中的ceRNA

ceRNA学说进一步揭示了骨肉瘤的发生发展机制。骨肉瘤中ceRNA的研究主要集中在lncRNA上,对circRNA或mRNA的研究相对较少。目前的研究结果证明,lncRNA、circRNA、mRNA通过ceRNA机制参与调控骨肉瘤的增殖、迁移、侵袭、血管生成、耐药等生物学行为。然而,在其他疾病中可作为ceRNA发挥作用的假基因及病毒RNA还未能在骨肉瘤中得到验证。


(一)lncRNA作为ceRNA

lncRNA是一类长度不超过200个核苷酸,不能翻译成蛋白质的转录本[29],曾被认为是基因组的暗物质。然而随着对转录组研究的深入,lncRNA被发现在基因表达的不同阶段发挥调控功能,包括染色质修饰、转录、转录后和翻译[30,31,32]。在ceRNA网络中,lncRNA可作为内源性ceRNA与miRNA相互竞争,发挥"海绵"的功能[33],在基因表达中发挥转录后调控作用,包括介导肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭[34,35],同时也可在肿瘤耐药、血管生成等机制中发挥调节作用[36,37]


许多研究表明,部分lncRNA在骨肉瘤细胞或组织中表达异常,可通过lncRNA-miRNA-mRNA通路发挥ceRNA生物学效应调控骨肉瘤细胞的表型,包括增殖、凋亡和转移等过程。Wang等[38]发现骨肉瘤细胞HOTAIR高表达,作为ceRNA海绵miR-217,上调miR-217下游的mRNA ZEB1的表达,促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,并抑制凋亡。类似地,Dai等[39]发现Hoxa-AS2在骨肉瘤组织中表达上调,吸收miR-30a并抑制其表达,从而促进FOXA1的表达,促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制骨肉瘤细胞的凋亡。此外,Shen等[40]报告骨肉瘤中高表达的KCNQ1OT1竞争性结合miR-34c-5p,可减轻miR-34c-5p对ALDOA的抑制作用,提高mRNA ALDOA的表达,从而增强骨肉瘤的有氧糖酵解,促进骨肉瘤细胞的增殖和生存。另外,有研究发现一些在骨肉瘤中低表达的lncRNA也可通过ceRNA发挥生物学效应。Liu等[41]发现骨肉瘤细胞中lncRNA NR_136400表达下调,并证明了lncRNA NR_136400竞争性地与miR-8081结合,进而上调抑癌基因TUSC5的表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。上述研究表明这些在骨肉瘤发生机制中充当ceRNA发挥调控作用的lncRNA都有可能成为骨肉瘤治疗的新靶点,也因为这些lncRNA的表达差异,赋予了它们作为骨肉瘤一种新的潜在生物标志物的潜力[42,43]


lncRNA作为ceRNA通过lncRNA-miRNA-mRNA调控通路,还能在骨肉瘤化疗耐药机制中发挥作用。Zhu等[44]鉴定了三对多药化疗耐药和化疗敏感骨肉瘤细胞系中的lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA的表达谱,构建了ceRNA网络,证实lncRNA MEG3作为ceRNA通过海绵miR-200b-3p上调AKT2表达,增加了骨肉瘤细胞对阿霉素的耐药性。此外,Shi等[45]发现骨肉瘤中lncRNA PWRN1通过抑制骨肉瘤细胞增殖、异种移植瘤的生长和增强对顺铂的敏感性来发挥抗癌作用。其潜在的机制是lncRNA PWRN1通过与miR-214-5p结合并相互作为ceRNA调控对方的表达;当上调hsa-miR-214-5p时可逆转PWRN1在骨肉瘤细胞中的抗癌作用,说明lncRNA可通过lncRNA-miRNA-mRNA调控骨肉瘤化疗耐药,而干预这一信号轴可为逆转骨肉瘤耐药提供新的思路。


(二)circRNA作为ceRNA

circRNA是一类具有共价闭环结构的内源性ncRNA,可直接由线性mRNA前体的下游3’剪接位点和上游的5’剪接位点之间结合形成,具有结构稳定、组织特异性表达的特点[46,47,48]。与线性RNA相比,由于缺少容易暴露的3’和5’末端,circRNA更能抵抗RNA剪切酶的降解,从而能够维持一个稳定的环[49]。这也赋予了它作为不同疾病,特别是癌症的诊断生物标志物的潜质。早在40多年前,circRNA就在RNA病毒中被发现[50],但由于技术的局限及研究的不深入曾被认为是缺乏功能的翻译副产品[51]。随着实验方法的改进,circRNA的作用越来越清晰,更多的证据表明circRNA在包括骨肉瘤在内的一系列恶性肿瘤的细胞增殖、凋亡、迁移和代谢等方面发挥着至关重要的调节作用[52,53]


由于circRNA具有"miRNA海绵"功能[54],因此可在转录和转录后调控中发挥关键作用。与lncRNA相似,circRNA可以与miRNA结合,作为ceRNA在骨肉瘤发生发展机制中发挥重要作用[55]。本综述共纳入13篇circRNA在骨肉瘤中作为ceRNA的相关文章,证明circRNA通过circRNA-miRNA-mRNA轴发挥生物学作用,其中hsa_circ_001564、circ-0001785、hsa_circ_0009910、circEPSTI1、circ_0102049、circ RNA-0008717、circPVT1、circEIF4G2、circFAT1、circ-XPO1在骨肉瘤细胞中表达上调,能促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移或侵袭;相反,hsa_circ_0002052、hsa_circ_0008792表达下调,抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移或侵袭(表1)。

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(三)mRNA作为ceRNA

传统观念认为mRNA是ncRNA调控靶点,然而许多mRNA在其3’UTR上有多个MRE[67],可通过MRE竞争结合miRNA调控其他mRNA和ncRNA,这一特性赋予了mRNA反式调节功能[68]。这些不同种类RNA之间相互调节的交错关系,构成了RNA的多维调控网络。


现有大量研究证明,mRNA通过ceRNA方式在包括乳腺癌、黑色素瘤、肝癌等多种恶性肿瘤中发挥重要的生理功能[69,70,71]。例如,mRNA FOXO1在乳腺癌中作为ceRNA与mRNA E-cadherin竞争结合miR-9,从而调控乳腺癌细胞的转移[70];mRNA ZEB2在黑色素瘤中通过ceRNA机制调控黑色素瘤细胞的恶性转化[69]。在骨肉瘤的相关研究中,Gao等[72]发现胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)mRNA在骨肉瘤中作为ceRNA竞争性结合miR-29,降低了miR-29对血管内皮生长因子mRNA的抑制作用,血管内皮生长因子的表达和分泌增多,从而促进骨肉瘤血管生成。血管生成是骨肉瘤发生发展的关键过程,IGF-1 mRNA或许可成为新的靶点,有助于开发更有效的抗骨肉瘤血管生成的靶向药物。


在ceRNA理论中,拥有与共享miRNA相同MRE的转录物即有成为ceRNA的可能,而大多mRNA在其3’UTR上有多个MRE,因此大量mRNA通过ceRNA机制在癌症中发挥基因调控功能。遗憾的是,目前仅有Gao等[72]的研究证明了IGF1 mRNA通过ceRNA机制在骨肉瘤中发挥基因调控功能。可以推断,还有更多的mRNA通过ceRNA机制在骨肉瘤基因调控网络中发挥重要作用,mRNA在骨肉瘤中的ceRNA作用机制有广阔的研究前景。


(四)假基因作为ceRNA

假基因是与已知的功能基因相似的一种特殊基因序列,在产生过程中由于有害突变(包括过早终止密码子、插入、缺失、点突变等)丧失了编码蛋白质的功能[73]。曾经假基因被认为是无用的垃圾基因序列,但最近的研究表明一些假基因以不同的方式在转录后水平发挥作用[74]。其中,通过ceRNA作用机制是假基因发挥基因调控作用的一种重要方式,且这种作用方式已在多种癌症中得到证明[75]。然而,目前还没有直接证据表明假基因在骨肉瘤中通过ceRNA的调控形式发挥作用。最近,Shi等[76]研究发现假基因MSTO2P通过上调PD-L1增强缺氧诱导的骨肉瘤细胞的生长、侵袭和上皮-间充质转换。虽然他们没有验证假基因MSTO2P作用于骨肉瘤的具体机制,但这暗示了假基因MSTO2P可能作为ceRNA竞争结合miRNA,从而调控PD-L1的表达。


目前,在人类基因组中已发现约14 000个假基因。假基因与亲本基因有高度同源性,且两者存在许多相同的MRE[77,78],因此假基因是理想的ceRNA。可以推断,骨肉瘤中存在一定量的假基因作为ceRNA发挥基因调控作用,但这还需要进一步研究证实。


四、ceRNA网络在骨肉瘤中的作用

lncRNA、circRNA和假基因等多种转录物通过竞争共享的miRNA参与骨肉瘤的病理生理过程,形成一个巨大的调控网络,不断加深我们对各类转录物调控蛋白编码过程的认知。关键的miRNA和ceRNA可能代表着有潜力的新治疗靶点,在ceRNA网络中通过抑制miRNA以缓解其靶mRNA的过度抑制,恢复正常的细胞表型,是一种有前景的治疗策略[79]。例如人工miRNA抑制剂,通过载体进入细胞后竞相以完全或部分互补的方式结合miRNA,从而阻碍miRNA与自然靶mRNA的结合,增强mRNA的稳定性及促进其翻译[80]。目前,人工miRNA抑制剂已广泛应用于miRNA功能缺失研究和miRNA高表达疾病的基因治疗。此外,一种基于ceRNA理论的新型人工miRNA抑制剂——人工miRNA海绵,模拟了ceRNA吸收miRNA,相比传统的人工miRNA抑制剂及基因敲除技术,有着稳定性高、长效、作用广泛的优点[81]。然而,目前人工miRNA抑制剂在骨肉瘤中的应用仍处于细胞或动物实验阶段,与临床应用还有一定的距离。


五、总结与展望

ceRNA是近十年来兴起的学说,它揭示了RNA的相互调控作用,打破了蛋白质编码基因只有翻译成蛋白质才能发挥功能的传统观念,加深了对骨肉瘤基因调控网络的认识,ceRNA网络的重要节点分子或许能成为骨肉瘤早期诊断的标志物,甚至是治疗的靶点。


值得注意的是,目前报道的骨肉瘤ceRNA可能只代表其复杂ceRNA网络的很小一部分,主要的研究在于lncRNA、circRNA,而在其他疾病中可作为ceRNA的假基因、病毒RNA并没有在骨肉瘤中得到证实。此外,rRNA和tRNA已被证实可以与Argonaute蛋白相互作用[82],或许是骨肉瘤中潜在的ceRNA。未来我们应识别更多的骨肉瘤ceRNA,构建更完善的ceRNA网络,并在此基础上进一步推进人工miRNA抑制剂的研究,开发新的骨肉瘤治疗方式。


目前,ceRNA学说还处于初级阶段,在预测、诊断和治疗骨肉瘤方面的应用仍面临一些挑战。例如,如何特异性靶向ceRNA或miRNA而不影响正常的基因表达,如何向癌细胞内输送ceRNA。此外,ceRNA活性受多种因素影响,包括ceRNA成分的丰度、亚细胞位置、miRNA的亲和力以及RNA编辑等,这些挑战和影响ceRNA活性的因素阻碍了ceRNA在骨肉瘤临床实践中的应用。ceRNA学说进一步完善了骨肉瘤基因调控网络,为骨肉瘤发生、发展机制提供了新的认知,有助于开发基于RNA的骨肉瘤的诊断和治疗新策略。